Nowe sondy do wykrywania bakterii z gatunku Acinetobacter baumannii, oligonukleotydowe startery, sposób oraz zestaw do analizy próbek medycznych i środowiskowych

Acinetobacter baumannii to oportunistyczny patogen o istotnym znaczeniu klinicznym. Często zasiedla środowisko szpitalne. Zagraża przede wszystkim pacjentom z obniżoną odpornością, przebywającym na oddziałach intensywnej opieki medycznej. Jest odpowiedzialny za wywoływanie zakażeń układu moczowego, groźnych infekcji ran oraz rozległych oparzeń, a także zapalenia płuc i wtórnego zapalenia opon mózgowych. To właśnie zapalenia płuc o ciężkim przebiegu są najczęściej wykrywaną w ostatnich latach chorobą wywoływaną przez A. baumannii.
Wysoka patogenność tego drobnoustroju związana jest z szeregiem charakterystycznych dla całego gatunku cech, takich jak zdolność do zasiedlania i długotrwałego przebywania na powierzchniach abiotycznych, niewrażliwość na wiele środków antybakteryjnych stosowanych do dezynfekcji, czy wysoki poziom kompetencji genetycznej, dzięki czemu nabywa on bardzo szybko lekooporności. Szacuje się, że obecnie ok. 10-30% izolatów szpitalnych należy do grupy wielolekoopornych. Nawet wrażliwość na antybiotyki z grupy karbapenemów w ciągu ostatniej dekady zaczęła znacząco maleć, sugerując że być może era antybiotykowa w kontekście A. baumannii skończy się szybciej niż jest to przewidziane dla metycilino-opornych szczepów S. aureus (MRSA), stanowiących do tej pory największe zagrożenie.
Czas potrzebny na postawienie właściwej diagnozy odgrywa ważną rolę w skutecznym leczeniu infekcji wywołanych przez ten patogen. Niestety, obecnie stosowane metody diagnostyczne opierają się na mikrobiologii klasycznej, więc do wykonania oznaczenia wymagane jest uzyskanie czystej hodowli bakteryjnej. Standardowo na otrzymanie wyników analizy czeka się od 3 do 7 dni. Co więcej, z uwagi na to, iż powyższe testy opierają się na cechach fenotypowych, które są bardzo zmienne wśród mikroorganizmów, pozwalają na określenie przynależności gatunkowej badanego izolatu jedynie w pewnym przybliżeniu, nigdy nie dając 100% pewności.
Poszukiwanie ulepszonego i uproszczonego sposobu identyfikacji poprzez zastosowanie technik molekularnych doprowadziło do opracowania przez nas sposobu i zestawu do analizy materiału genetycznego pod kątem obecności Acinetobacter baumannii. Zestaw ten bazuje na technice Real-Time PCR, która jest bardzo dobrze znana i dosyć powszechnie stosowana w nowoczesnych laboratoriach diagnostycznych. Reakcja Real-Time PCR jest reakcją wykorzystywaną do monitorowania ilości przyrostu kopii badanej sekwencji w czasie. Identyfikacja jest możliwa dzięki zastosowaniu sond znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi. W naszym zestawie zdecydowaliśmy się wykorzystać sondy typu TaqMan ze względu na ich wysoką specyficzność. Całość składa się z dwóch par starterów, przy pomocy których powielane są wybrane fragmenty silnie konserwowanych genów (charakterystycznych dla całego gatunku) oraz dwie sondy zdolne do przyłączania się do zamplifikowanych fragmentów. Co więcej, przeprowadzanie reakcji w dupleksie (dodając dwie sondy i odpowiadające im startery do jednej mieszaniny reakcyjnej) pozwala na eliminację próbek dających wynik fałszywie pozytywny, gdyż za dodatnie uznajemy wyłącznie próbki, gdzie wykrywamy sygnał fluorescencji pochodzący z obu sond. To sprawia, że metoda jest bardzo wiarygodna.
Opracowaliśmy również wydajny sposób przygotowania próbki przed wykonaniem oznaczenia,
który sprowadza się do prostego wirowania, w celu zagęszczenia ilość materiału do badań i lizy termicznej komórek bakteryjnych prowadzącej do izolacji DNA, służącego jako matryca w reakcji Real-Time PCR. Ograniczenie manipulacji na badanych próbach jest bardzo cenne, gdyż minimalizuje ryzyko ich kontaminacji.
Warto podkreślić, że zarówno przygotowanie próbki jak i przeprowadzenie reakcji Real-Time PCR nie jest skomplikowane, a pozwala zaoszczędzić dużo czasu, który jak już wspomniałam ma kluczowe znaczenie z punktu widzenia klinicystów.

Jako, że do tej pory na rynku nie ma dostępnego molekularnego testu do wykrywania Acinetobacter baumannii, wierzymy że zaprojektowany przez nas zestaw będzie cieszył dużym zainteresowaniem potencjalnych użytkowników. Zwłaszcza biorąc pod uwagę fakt, że technika Real-Time PCR jest bardzo dobrze znana i dosyć powszechnie stosowana w nowoczesnych laboratoriach diagnostycznych zarówno krajowych jak i zagranicznych. Posiadają one przeszkolony w tym kierunku personel oraz odpowiedni sprzęt do wykonywania tego rodzaju doświadczeń. Dlatego proponowany test jest dla nich szczególnie atrakcyjny, gdyż nie wymaga zaangażowania dodatkowych środków na jego wdrożenie i wprowadzenie do podstawowej oferty.
Warto podkreślić również fakt, ze test jest uniwersalny, wystarczy zastosować odpowiednie barwniki do wyznakowania sond, aby można było z powodzeniem wykonywać oznaczenia na każdej platformie Real-Time PCR.
Również nowi użytkownicy, którzy wcześniej nie mieli do czynienia z techniką Real-Time PCR w diagnostyce drobnoustrojów, nie powinni mieć żadnych problemów, gdyż cała procedura jest nieskomplikowana i bardzo łatwa do przyswojenia.

Acinetobacter baumannii, test diagnostyczny, test molekularny, technika Real-Time PCR, sondy typu TaqMan

Opracowany przez nas zestaw do molekularnego oznaczania obecności bakterii Acinetobacter baumannii w próbach szpitalnych oraz środowiskowych wykazuje szereg zalet w stosunku do stosowanych dotychczas metod mikrobiologii klasycznej (hodowla na podłożach wybiórczych, różnicujących, testy biochemiczne). Po pierwsze nie wymaga on uzyskania czystej hodowli bakteryjnej przed przystąpieniem do oznaczania. Detekcję wykonuje się bezpośrednio na dostarczonej próbie, co zmniejsza ryzyko jej zanieczyszczenia, a także znacząco skraca czas potrzebny do otrzymania wyniku. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej oraz przeprowadzenie samej reakcji Real-Time PCR zajmuje ok. 2 godzin. Jednorazowo można oznaczać wiele prób, co również przyspiesza pracę. Cała procedura opiera się na amplifikacji (powielaniu) charakterystycznych, stałych (niezmiennych) fragmentów DNA bakterii, dlatego daje ona wiarygodne wyniki. Jesteśmy w stanie odróżnić szczepy bardzo blisko spokrewnione, o bardzo podobnych cechach fenotypowych, jednak należące do różnych gatunków rodzaju Acinetobacter o odmiennym znaczeniu klinicznym, co jest prawie niemożliwe przy standardowych procedurach mikrobiologicznych. Dużą zaletą opracowanego zestawu będzie również jego cena, gdyż zmniejszając czasochłonność wykonania oznaczenia, znacząco redukujemy koszty z nim związane.
Efektem wdrożenia naszego wynalazku będzie możliwość szybkiej diagnozy, potwierdzenia bądź wykluczenia czynnika wywołującego zakażenie. Dzięki temu łatwiej będzie wdrożyć odpowiednie leczenie. Zredukujemy tym samym konieczność stosowania antybiotyków o szerokim spektrum czy terapii kombinowanej, co oprócz zwiększenia bezpieczeństwa, powinno także zredukować znacząco koszty leczenia. Co więcej (w przypadku epidemii szpitalnych) łatwa i szybka detekcja pomoże w przeprowadzaniu dochodzenia epidemiologicznego, które wskaże drogi rozprzestrzeniania się tego drobnoustroju i ułatwi jego eradykację ze środowiska szpitalnego.

- Twórca jest zainteresowany nawiązaniem współpracy w celu dalszych badań nad wynalazkiem
- Twórca jest zainteresowany wdrożeniem wynalazku
- Twórca wyraża zgodę na udział w Spotkaniu Brokerskim
- Twórca jest zainteresowany zbyciem praw majątkowych do wynalazku